Сравнительная оценка методов определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Ускоренные методы выявления микобактерий

Культивирование на жидких питательных средах

Во всем мире, а в последние 10 лет и в ряде крупных лабораторий РФ, широко используются системы с автоматической детекцией роста микобактерий, которые позволяют сократить время получения результата, по сравнению с посевом на плотные питательные среды, до 7-14 дней.

https://www.youtube.com/watch?v=upload

Культивирование микроорганизмов производится в специальных пробирках с жидкой питательной средой. Регистрация роста микроорганизмов осуществляется автоматически с помощью фотодатчиков. В основе метода лежит флуоресценция, возникающая при потреблении кислорода в процессе роста микобактерий.

Основными достоинствами метода являются ускорение получения результата и получение чистой культуры, которую можно использовать для дальнейшего исследования лекарственной чувствительности, в т. ч. и молекулярно-генетическими методами.

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрировано большое количество наборов реагентов для выявления ДНК МБТ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), отличающихся способом детекции продуктов амплификации, среди которых предпочтительными являются наборы с детекцией в режиме реального времени.

Наборы реагентов для выявления ДНК МБТ методом ПЦР основаны на выявлении в геноме микобактерий видоспецифических последовательностей, например IS6110 для МТК. Получение положительного результата методом ПЦР позволяет в течение 1-2 дней установить наличие МБТ в диагностическом материале.

К достоинствам выявления МБТ методом ПЦР можно отнести то, что выявлять возбудителя можно непосредственно в диагностическом материале с высокой специфичностью и чувствительностью. Получение положительного результата методом ПЦР не требует дополнительной дифференциации МТК от НТМ, т. к.

положительный результат однозначно указывает на принадлежность к МТК. ДНК, выделенная из диагностического материала и использованная для проведения ПЦР, может быть использована для определения лекарственной устойчивости существующими молекулярно-биологическими наборами реагентов.

В целом, внедрение ПЦР позволило значительно сократить сроки подтверждения диагноза туберкулеза и контролировать эффективность химиотерапии у больных туберкулезом легких с отрицательными результатами бактериоскопии и посева.

Молекулярно-биологические наборы реагентов для определения лекарственной устойчивости представлены четырьмя основными вариантами: биологические микрочипы, ПЦР в режиме реального времени, ДНК-стри- повая технология, набор Xpert MTB/RIF.

Основным достоинством всех молекулярно-биологических методов тестирования лекарственной устойчивости МБТ является быстрота получения результатов и оперативное выявление больных туберкулезом, т. к. все указанные методы позволяют выявить устойчивость к рифампицину, которая считается маркером множественной лекарственной устойчивости.

Методы имеют много важных преимуществ для совершенствования контроля за лекарственно устойчивым туберкулезом, особенно это касается скорости получения результата, стандартизации тестов, возможности высокой производительности и сниженной необходимости в соблюдении требований обеспечения биологической безопасности.

Применение молекулярно-биологических методов позволяет проводить определение лекарственной чувствительности МБТ с использованием непосредственно диагностического материала. В этом случае получение результата о наличии у больного множественной лекарственной устойчивости к туберкулезу возможно через 1-2 дня после поступления материала.

Однако использование молекулярно-биологических методов в настоящее время не устраняет необходимости применения традиционных культуральных методов, т. к. иногда в диагностическом материале оказывается недостаточное количество МБТ.

Предлагаем ознакомиться:  Бульбит желудка разновидности и симптоматика заболевания методы лечения

Определить устойчивость к изониазиду и рифампицину позволяют как отечественные тест-системы – наборы реагентов “ТБ-биочип” (ООО “БИОЧИП”, Россия), в основе которых лежит технология биологических микрочипов, наборы реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени (ЗАО “Синтол”), так и зарубежные, такие как набор GenoType® MTBDRplus (HAIN Lifescience, Германия), представляющий собой ДНК-стриповую технологию, основанную на множественной обратной гибридизации (позволяет определять лекарственную устойчивость МБТ к рифампицину и изо- ниазиду).

Отдельно стоит упомянуть тест, выполняемый с помощью набора реагентов Xpert MTB/RIF на анализаторе GeneXpert. Использование этой системы позволяет выявлять возбудителя непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки, в один этап, определять его принадлежность к МТК и лекарственную чувствительность (к рифампицину). Преимущества системы GeneXpert:

  • выделение и амплификация производятся в картридже, предварительная обработка диагностического материала сводится к минимальным манипуляциям;
  • возможность контаминации резко сокращается;
  • не требуется зонирования помещений.

Из молекулярно-биологических методов для определения лекарственной чувствительности возбудителя к препаратам второго ряда можно упомянуть отечественный набор реагентов “ТБ-биочип-2” (ООО “Биочип”), позволяющий определять на микрочипе чувствительность к фторхиноло- нам, и набор GenoType® MTBDRsl (HAIN Lifescience, Германия), основанный на технологии ДНК-стрипов и позволяющий определять устойчивость к фторхинолонам, этамбутолу, аминогликозидам.

Последний представляется в настоящее время наиболее приемлемым для мониторинга штаммов с устойчивостью к основным препаратам второго ряда, в т. ч. и с широкой лекарственной устойчивастью, поскольку этот набор обеспечивает возможность тестирования лекарственной устойчивости к наибольшему количеству противотуберкулезных препаратов.

В настоящее время выпускается один набор реагентов (Magellan Biosciences), позволяющий определять лекарственную чувствительность НТМ. Метод основан на культивировании выделенной культуры микобактерий в 96-луночном планшете на жидких питательных средах, содержащих разные концентрации антибактериальных, в т. ч.

противотуберкулезных, препаратов. Для медленнорастущих и быстрорастущих НТМ лекарственная чувствительность определяется к разному спектру препаратов. Для быстрорастущих НТМ такими препаратами являются триметоприм / сульфам- токсазол, ципрофлоксацин, моксифлоксацин, цефоксицин, амикацин, док- сициклин, тайгециклин, кларитромицин, линезолид, имипенем, цефепим, амоксициллин / клавулоновая кислота, цефтриаксон, миноциклин, тобра- мицин.

Определение лекарственной чувствительности НТМ проводится в бактериологических лабораториях не ниже третьего уровня и требует наличия соответствующей материально-технической базы и высококвалифицированного персонала.

Таким образом, для ускоренной лабораторной диагностики туберкулеза в отделе микробиологии ЦНИИТ РАМН используется следующая схема исследования. Применение данной схемы сокращает сроки выявления возбудителя, его видовой идентификации и определения лекарственной чувствительности, ускоряя постановку диагноза и способствуя своевременному назначению адекватных схем химиотерапии, что, в свою очередь, повышает эффективность лечения туберкулеза.

Предлагаем ознакомиться:  Кокки в мазке у женщин. Что это, если обнаружены палочки на флору, причины, лечение, при беременности, положительные, единичные, полиморфные

Материал проверен экспертами Актион Медицина

Идентификация вида возбудителя

Лечение заболеваний, вызванных НТМ, устойчивыми к противотуберкулезным препаратам, радикально отличается от лечения лекарственно устойчивого туберкулеза. Лаборатории, проводящие определение лекарственной чувствительности, должны как минимум дифференцировать МБТ от других НТМ.

В рамках данной статьи не будут рассматриваться методы идентификации по культуральным свойствам (особенностям роста культуры) на плотных питательных средах и биохимические тесты, применяемые в основном при культивировании на плотных питательных средах.

В случае ускоренной диагностики туберкулеза видовая идентификация является актуальной для быстрых культуральных методов.

При получении положительного роста культуры на жидких питательных средах необходимо исключить контаминацию посторонней микрофлорой. Обязательным является проведение микроскопических исследований с использованием окрасок, специфических для КУМ.

Если КУМ в мазке не выявляются, то можно сделать вывод о контаминации. Также для контроля контаминации проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста культуры через 24 ч инкубации при 36 °С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

Молекулярные методы дифференциации МБТ от НТМ основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Ряд методов направлены только на то, чтобы дифференцировать МБТ от НТМ, другие пригодны для точной видовой идентификации возбудителя.

К методам, позволяющим дифференцировать МБТ от НТМ, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность IS6110, присутствующую только у МТК.

Особенно удобен для точной идентификации МБТ быстрый иммунохроматографический метод, который отличается простотой выполнения и обеспечивает идентификацию за 15-20 мин. Тест основан на обнаружении фракции белка MPT64, которая выделяется из клеток МТК в процессе культивирования.

Клинические испытания экспресс-метода хроматографического иммуноанализа для определения антигена MTBC (Mycobacterium tuberculosis complex) в пробирках BD MGIT показали полное совпадение результатов идентификации (бактериоскопия, ПЦР, биохимические тесты).

В случае получения отрицательного результата выявления МТК предполагается наличие НТМ и проводится точная видовая идентификация. Точная видовая идентификация может быть также рекомендована при получении отрицательного результата ПЦР при выявлении возбудителя в диагностическом материале. В этом случае работа ведется с диагностическим материалом.

К методикам, обеспечивающим точную видовую идентификацию НТМ, относится ДНК-стриповая технология (Hain Lifescience, Германия), включающая два вида тестов:

  • GenoType® Mycobacterium CM, позволяющий идентифицировать следующие виды микобактерий: M. avium ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum, M. ulcerans, M. xenopi и M. tuberculosis complex.
  • GenoType® Mycobacterium AS, который позволяет идентифицировать M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum и M. shimoidei.
Предлагаем ознакомиться:  Энтеробиоз особенности проявления и методы лечения

Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред, а также работать непосредственно с диагностическим материалом (в случае получения отрицательного результата выявления МТК методом ПЦР) и получить результат в течение 1-2 дней.

При необходимости видовой идентификации микобактерий, входящих в туберкулезный комплекс, может быть использован набор реагентов GenoType® MTBC, позволяющий идентифицировать M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis BCG, M. bovis ssp bovis, M. bovis ssp. caprae, M. microti и M. canetti.

Также идентификация видов микобактерий может проводиться с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии по различию спектра жирных кислот и MALDI-ToF масс-спектрометрии, позволяющей получить белковые спектры, которые являются уникальными для каждого вида микобактерий.

Определение лекарственной чувствительности

Определение устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет важное значение для выбора правильной тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий в пределах отдельной территории, страны и мирового сообщества.

Быстрое определение лекарственной чувствительности позволяет на этапе фазы интенсивной терапии назначить эффективные препараты.

К ускоренным методам определения лекарственной чувствительности можно отнести культивирование микобактерий в присутствии противотуберкулезных препаратов (наличие роста культуры указывает на лекарственную устойчивость, а ингибирование роста – на лекарственную чувствительность), например в системе BACTEC MGIT960, а также на плотных питательных средах с использованием реактива Грисса, и генотипические методы, выявляющие специфические мутации, связанные с резистентностью к определенным препаратам.

Определение лекарственной чувствительности к препаратам первого ряда является первоочередной задачей.

Поэтому большинство генотипических методов направлено на выявление альтераций в геноме, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду, а нередко и только к рифампицину, т. к. устойчивость к рифампицину является надежным индикатором, указывающим на туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью.

Если определение лекарственной чувствительности проводится на плотных питательных средах, то для ускорения получения результата (до 9-12 дней) возможно применение нитратредуктазного теста, который основан на способности МБТ восстанавливать нитраты в нитриты, которые детектируются реактивом Грисса.

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertisede

Данный метод относится к некоммерческим и, хотя и является менее дорогостоящим, чем коммерческие системы, при его использовании возможно получение ошибочных результатов вследствие отсутствия стандарта.

Поэтому, при наличии достаточного материального обеспечения, для ускорения получения результатов определения лекарственной чувствительности к препаратам первого и второго ряда желательно использование автоматизированных систем детекции роста, которые позволяют получить результат даже на несколько дней раньше, чем в случае применения нитрат- редуктазного теста, и отличаются наличием строгих лабораторных протоколов, стандартного порядка проведения операций и механизмов внутреннего контроля качества.

Ссылка на основную публикацию

Adblock detector